western blot 常見問題及解決辦法

     我們在做WB時(shí)zui常遇到的問題也是驚人的相似——樣品漂浮、蛋白條帶扭曲（無法準(zhǔn)確判斷蛋白分子量）、轉(zhuǎn)膜后看不到帶藍(lán)色或橙色的指示條帶、抗體孵育不均勻?qū)е缕毓舛炔町惡艽螅ㄒ廊皇菚?huì)影響到蛋白表達(dá)量的估算）。

     這些問題其實(shí)都或多或少與樣品前處理有關(guān)。也就是說，我們*可以通過優(yōu)化樣品處理手法，以及經(jīng)驗(yàn)累積，來獲得的WB結(jié)果。

     1.出現(xiàn)樣品漂浮怎么辦？？

     原因分析：樣品中含有未除凈的溶劑或雜質(zhì)，其密度比電泳緩沖液小

     解決辦法：處理組織或菌體時(shí)，需充分分散或裂解，確保目的蛋白盡可能的釋放；
     熱處理粗樣時(shí)，確保升溫迅速，并且金屬浴或水溫的實(shí)際溫度達(dá)到100℃（在海拔較高處水的沸騰不能確保溫度）；
     離心的轉(zhuǎn)速和時(shí)間足夠；
     吸取上清液時(shí)盡量不要碰到中間層

     2.蛋白條帶出現(xiàn)扭曲怎么辦？

     原因分析：分離膠的濃度與蛋白分子量不對應(yīng)；灌膠時(shí)間過長或過短，導(dǎo)致丙烯酰胺的交聯(lián)度不均勻

     解決辦法：根據(jù)目的蛋白的分子量選擇正確的分離膠濃度；
制備分離膠與濃縮膠時(shí)，應(yīng)保證緩沖液母液的正確稀釋，以及各組分的充分混勻（僅用移液器吹吸是不夠的，可以迅速用磁力攪拌器進(jìn)行混勻）

     3.轉(zhuǎn)膜后沒有指示條帶怎么辦?

     原因分析：如果此時(shí)SDS-PAGE膠上也沒有指示劑，則表明轉(zhuǎn)膜時(shí)間過長，蛋白穿膜（此時(shí)就沒有再繼續(xù)做下去的必要了）

     解決辦法：注意控制轉(zhuǎn)膜時(shí)間；
電泳液反復(fù)使用也可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜失敗

     4.抗體孵育不均勻怎么辦？

     原因分析：孵育時(shí)振蕩搖床轉(zhuǎn)速過快，或是混勻直徑不夠，導(dǎo)致孵育不充分或不均勻

     解決方法：確保搖床可以在50 rpm穩(wěn)定運(yùn)行；選擇振蕩直徑在5~10 mm范圍內(nèi)的搖床