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以毛細管轉移方式進行Northern Blotting轉印實驗

更新時間:2012-10-18   點擊次數:2402次

 以毛細管轉移方式進行Northern Blotting轉印實驗

要 進行北方雜合反應前,必須先將RNA自洋菜膠體轉移至硝化纖維紙(nitrocellulose membrane) 或尼龍膜 (nylon membrane) 上,這一個過程稱為轉印 (blotting)。 一般常用的方法包括毛細管轉移法 (capillary transfer)、真空轉移法 (vacuum transfer) 與電轉印法 (electroblotting)。 毛細管轉移法借助吸水紙吸收轉移緩沖液時所產生的牽引力量將RNA自洋菜膠體轉移至膜上;要轉印*,起碼需要作用6 h以上。 雖然所需花費的時間比較長,以其不須要特別的儀器設備,毛細管轉移法目前仍被普遍采用。 若分析RNA時采用變性聚丙烯酰胺膠體電泳,則必須以電轉印法進行RNA轉印。至于膜的選擇,硝基纖維素膜的優點是比較不會產生非專一性反應;不過其一旦 被潤濕再烘干的后,容易碎裂,不適用于進行多次雜合反應。 尼龍膜的優點是韌性好,與核酸結合的能力也相當強,正可以彌補硝基纖維素膜的缺點,現已成為主流。 一旦將RNA轉移至膜上后,即可以利用紫外線照射法 (uv irradiation) 或真空干燥法 (在真空下80℃加熱2 h) 將其固定于轉印膜上。

儀器用具:塑料盒;玻璃板;裁紙刀

藥品試劑:20×SSC (3 M NaCl, 300 mM sodium citrate);尼龍膜;3MM 濾紙;吸水紙;dH2O/DEPC

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方法步驟:

1) 將甲醛洋菜膠體移放在塑料盒內,以dH2O/DEPC沖洗數次,以便去除甲醛。

注意:在移動膠體時請特別留心,不要把膠體弄破了!

2) 注入100 mL 20×SSC,靜置5 min。

3) 根據圖所示,依序在塑料盒上堆棧玻璃板、濾紙 (作為鹽橋)、電泳膠、尼龍膜、三層濾紙、與吸水紙,以便以毛細管轉移方式將RNA 轉印于尼龍膜上;塑料盒內裝入適量20×SSC,以便作為轉移緩沖液。


以毛細管轉移法進行核酸轉印

注意:

a. 濾紙與尼龍膜應先以20×SSC 潤濕,再用于堆棧。

b. 在濾紙、尼龍膜、與電泳膠夾層間可能會有氣泡存在,因此在放好電泳膠、尼龍膜或濾紙后,應立即檢視,并以食指輕輕平移的方式小心趕走氣泡。

c. 此轉印步驟將持續至隔天才結束。




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